《食品科学》：中国农业大学曹建康教授等：低温等离子体对冷库贮藏‘金冠’苹果微生物群落的影响

  病原菌侵染是引起采后果蔬腐烂的根本原因，低温贮藏能抑制果蔬的呼吸作用和微生物的生长繁殖，延缓果蔬的采后衰老和降低腐烂发生率，但是低温无法杀灭果实表面微生物，因此低温贮藏期间仍需对果蔬的微生物群落进行干预和控制。除了表面微生物，果实中还有植物内生菌（endophyte）。植物内生菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生存于健康植物的各种组织和器官内部的细菌、真菌和放线菌，被感染的宿主植物不表现出明显的外在症状。一般地，植物内生菌对植物的生长起促进作用，部分高活性、多功能的内生菌还能加强宿主的抗逆性和抗病虫害的能力。

  因此，中国农业大学方琼、曹建康*和仲崇山采用高通量测序技术，以‘金冠’苹果为材料，对果蔬冷库果实表面真菌和内生细菌与内生真菌群落做多元化的分析，探究低温等离子体对苹果表面真菌和内生菌的群落结构及组成的影响，构建微生物共生网络，为低温等离子体在果蔬采后领域的发展和应用提供理论依据。

  在0 ℃冷库正常贮藏30 d时，对照组‘金冠’苹果的质量、硬度和SSC都没有显著变化（表1）。在处理冷库中低温等离子体循环工作时，监测到库中臭氧浓度在10 min内上升至10 μL/L，后逐渐缓慢下降，于45 min时降为0，按小时循环工作。低温等离子体处理对苹果的质量和SSC没有产生显著影响，但低强度低温等离子体长期处理会使苹果的硬度略微下降。与对照组相比，低温等离子体可以维持果皮色泽的明亮度，但是会使果肉色泽的明亮度略微下降，低温等离子体还可以延缓苹果颜色转黄的过程（图1）。

  冷库贮藏苹果表面真菌样品和内生菌样品高通量测序质量结果分别如表2和表3所示，所有样品覆盖率（Coverage）均达到0.999 9，说明测序数据量合理，测序结果可用于后续分析，测序深度可以真实反映冷库贮藏苹果表面真菌和内生菌群落多样性与物种组成情况。

  为了比较低温等离子体处理前后及对照组正常低温贮藏后的微生物群落相互之间的多样性差异，使用Tukey检验对不同处理组样品之间的α多样性指数进行了两两比较，得到的两两比较统计学差异如表4所示。PD whole tree指数是谱系多样性指数，兼顾考虑了物种丰度和进化距离，数值越大，则表示群落多样性越高。Chao 1指数对稀有物种敏感，与群落物种丰富度呈正相关。Shannon指数和Simpson指数兼顾物种丰富度和物种均匀度，其中Shannon指数对物种丰富度敏感性更高，Simpson指数对物种均匀度敏感性更高。

  低温等离子体处理前（AS0）和处理后（AS1）冷库中苹果表面真菌群落的α多样性指数之间均无显著性差异，而对照组（CKS）苹果表面真菌群落PD whole tree指数和Chao 1指数相较于AS0组和AS1组均非常明显升高。说明不经低温等离子体处理，正常低温贮藏时，冷库中苹果表面真菌群落的α多样性会非常明显升高。而低温等离子体低浓度持续处理30 d时，虽然不能降低冷库中苹果表面真菌的α多样性，但是能抑制其α多样性升高。在内生菌方面，发现低温等离子体处理前（NS0）、处理后（NS1）及对照组（CKE）之间内生细菌群落和内生真菌群落α多样性指数均无显著性差异，表明苹果内生菌α多样性不易受到低温等离子体处理的影响。

  将冷库苹果表面真菌群落和内生真菌群落的α多样性指数作比较，发现低温等离子体处理前（AS0 vs. NS0），表面线指数明显高于内生真菌群落，而其余α多样性指数无显著性差异。自然贮藏30 d时的对照组（CKS vs. CKE）内生真菌群落的Simpson指数极明显高于表面真菌群落，其余α多样性指数无显著性差异。说明贮藏过程中苹果表面真菌群落和内生真菌群落均在发生动态变化。低温等离子体处理后（AS1 vs. NS1），内生真菌群落的PD whole tree指数和Shannon指数均明显高于表面真菌群落，说明低温等离子体对表面线 低温等离子体对冷库贮藏‘金冠’苹果微生物群落β多样性的影响

  如图2所示，PC1和PC2明显区分了不同处理组之间的表面真菌群落以及内生细菌群落，组间差异均显著（R2＝0.467、P＝0.019；R2＝0.413、P＝0.025）。但是不同处理组之间的内生线）。表明低温等离子体可以影响贮藏过程中的表面真菌群落组成和内生细菌群落组成，对而内生真菌群落组成无显著影响。

  低温等离子体处理前（NS0）、处理30 d后（NS1）及正常低温贮藏30 d对照组（CKE），在门水平和属水平上相对丰度大于1%的主要内生细菌和内生线所示。

  在内生细菌方面，低温等离子体处理前后及对照组在门水平上的主要优势菌群均为蓝细菌门（Cyanobacteria）（47.68%、66.33%、57.10%）和变形菌门（Proteobacteria）（43.18%、31.52%、40.53%）。低温等离子体处理组和对照组中，厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度由处理前的5.90%分别下降为0.77%和1.07%。属水平上，处理前的优势菌群主要是未确定菌属的细菌（unidentified）（80.78%），其次是属于厚壁菌门的葡萄球菌属（Staphylococcus）（4.23%）和芽孢杆菌属（Bacillus）（3.13%），以及放线菌门的棒杆菌属（Corynebacterium）（1.73%）。对照组及低温等离子体处理组中，均是未确定菌属的细菌（unidentified）相对丰度较高（95.46%、92.17%），对照组中Bacillus相对丰度为1.21%，而低温等离子体处理组中其他菌属的平均相对丰度均不足1%，Corynebacterium相对丰度更是直接降为0。

  进行相关性分析时，根据Spearman检测验证的方法，分别选取了表面真菌、内生细菌和内生真菌样本中属水平绝对丰度前20的菌属，以对应的门作为legend，过滤掉P值大于0.05的或Spearman相关系数r＜0.6的结果，构建了表面真菌、内生细菌和内生线）。

  在表面真菌方面，正常低温贮藏时共生网络有17 个节点和40 条连线%为正连线A）。正连线说明菌属之间为正相关关系，关联菌属之间生态位较为相似或存在互利共生的关系。负连线说明菌属之间为负相关关系，关联菌属之间有几率存在相互拮抗或相互竞争的关系。连通度较高的菌属有Mortierella、球腔菌属（Phaeosphaeria）、葡萄孢属（Botrytis）、Vishniacozyma、Penicillium和Metschnikowia，表明这些菌属在苹果表面真菌群落结构中起着及其重要的作用。低温等离子体处理低温贮藏时，共生网络有18 个节点和31 条连线%为正连线%为负连线B）。连通较高的关键菌属有Stephanonectria、节担菌属（Wallemia）和Papiliotrema。正常低温贮藏及有低温等离子体处理时，连通度较高的类群均为Ascomycota和Basidiomycota。

  在内生细菌方面，正常低温贮藏时共生网络有13 个节点和30 条连线%为正连线%为负连线C）。连通度较高的关键菌属有链球菌属（Streptococcus）、脱硫杆菌门（Desulfobacterota）的未培养细菌属（uncultured）、不动杆菌属（Acinetobacter）、假单胞菌属（Pseudomonas）、乳杆菌属（Lactobacillus）和Corynebacterium。Proteobacteria为连通度较高的内生细菌类群。低温等离子体处理低温贮藏时，共生网络有15 个节点和27 条连线%正连线%为负连线，菌群中负相关关系增多（图6D）。连通度较高的关键菌群为布赫纳氏菌属（Buchnera）、Staphylococcus和Corynebacterium。在内生细菌共生网络中也观察到低温等离子体使其简化的现象。

  在内生真菌方面，其共生网络均比表面真菌和内生细菌共生网络相对简单。正常低温贮藏时内生线 条连线，连通度较高的菌属只有伽穆孢属（Gamsia）（图6E）。低温等离子体处理低温贮藏时，共生网络有16 个节点和13 条边，连通度较高的菌属为镰刀菌属（Fusarium）、Lysurus和Cladosporium（图6F）。低温等离子体处理时，构建的内生真菌共生网络比正常贮藏时更复杂，负相关关系的比例增多。

  本研究进一步揭示，低温等离子体处理可以显著抑制低温贮藏苹果表面真菌群落α多样性的升高和改变群落组成，并且降低部分内生菌的丰度。冷库贮藏苹果带有Penicillium、Aspergillus、Rhizopus、Wallemia、Acremonium等真菌。Acremonium和枝孢属可能来自田。嗜热子囊菌属（Thermoascus）和篮状菌属（Talaromyces）均始终与Aspergillus存在较强的正相关关系，可能为潜在的采后危害菌。Papiliotrema在表面真菌共生网络中始终与Penicillium为较强的负相关关系，存在竞争或拮抗关系，可筛选潜在的微生物拮抗菌。Botrytis作为已知的采后危害菌，低温等离子体可以使其从共生网络中消失。低温等离子体能够更好的降低冷库中苹果表面真菌群落的多样性，使Penicillium、Aspergillus和Acremonium等真菌相对丰度明显降低，说明低温等离子体能应用于冷库果蔬，以干预果蔬表面微生物群落结构，抑制一些潜在危害菌的生长繁殖。

  Buchnera与Streptococcus、Staphylococcus、Escherichia-Shigella、Corynebacterium、未培养细菌等潜在危害菌之间均为较强的负相关关系，且始终在内生菌共生网络中与其他菌属呈负相关关系，可能具有竞争抑制作用。冷库苹果内生细菌群落结构组成比内生真菌群落结构组成简单，但是构建得到的内生细菌共生网络比内生真菌共生网络复杂，这原因是内生细菌中菌属相对丰度虽然较低，但是各关键菌属在微生物菌群中的相互关系更敏感，产生的影响更大。

  本研究中，低温等离子体处理可以明显降低冷库中贮藏的苹果表面真菌群落的α多样性，并干预其结构组成，使Penicillium、Aspergillus和Acremonium等采后潜在危害菌属相对丰度明显降低，共生网络的变化也阐释了低温等离子体对苹果表面真菌群落的有效干预及对潜在危害菌或潜在拮抗菌的预测。低温等离子体虽对低温贮藏‘金冠’苹果内生菌群落的α多样性无显著影响，但是对内生菌群落的组成结构及丰度有一定的影响，构建的共生网络进一步揭示了苹果内生菌群落之间的相互关系，为利用低温等离子体处理控制苹果内生菌及表面微生物的深入研究提供了理论基础。

  本文《低温等离子体对冷库贮藏‘金冠’苹果微生物群落的影响》来源于《食品科学》2023年44卷11期143-151页. 作者：方琼，曹建康，仲崇山. DOI: 10.7506/spkx0509-111. 点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

  实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

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